Asante kwa kutembelea nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo wa CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza kutumia toleo jipya la kivinjari (au kuzima hali ya utangamano katika Internet Explorer). Zaidi ya hayo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tovuti hii haitakuwa na mitindo na JavaScript.
Misuli ya mifupa ni tishu isiyo ya kawaida inayoundwa zaidi na myofibrili, ambazo kwa binadamu kwa kawaida hugawanywa katika aina tatu: moja "polepole" (aina ya 1) na mbili "haraka" (aina ya 2A na 2X). Hata hivyo, tofauti kati na ndani ya aina za myofibrili za kitamaduni bado hazieleweki vizuri. Tulitumia mbinu za transcriptomic na proteomic kwa myofibrili 1050 na 1038 za kibinafsi kutoka kwa vastus lateralis ya binadamu, mtawalia. Utafiti wa proteomic ulijumuisha wanaume, na utafiti wa transcriptomic ulijumuisha wanaume 10 na wanawake 2. Mbali na isoforms nzito za mnyororo wa myosin, tulitambua protini za kimetaboliki, protini za ribosomal, na protini za makutano ya seli kama vyanzo vya utofauti wa kati ya myofibrili zenye vipimo vingi. Zaidi ya hayo, licha ya kutambuliwa kwa makundi ya nyuzi za polepole na za haraka, data yetu inaonyesha kwamba nyuzi za aina ya 2X haziwezi kutofautishwa kwa njia ya phenotypic na nyuzi zingine zinazobadilika haraka. Zaidi ya hayo, uainishaji unaotegemea mnyororo mzito wa myosini hautoshi kuelezea aina ya myofiber katika miopathia ya nemaline. Kwa ujumla, data yetu inaonyesha tofauti ya myofiber yenye vipimo vingi, huku vyanzo vya tofauti vikienea zaidi ya isoforms za mnyororo mzito wa myosini.
Utofauti wa seli ni sifa ya asili ya mifumo yote ya kibiolojia, ikiruhusu seli kujikita katika kukidhi mahitaji tofauti ya tishu na seli.1 Mtazamo wa kitamaduni wa tofauti za nyuzi za misuli ya mifupa umekuwa kwamba niuroni za mwendo hufafanua aina ya nyuzi ndani ya kitengo cha mwendo, na kwamba aina ya nyuzi (yaani, aina ya 1, aina ya 2A, na aina ya 2X kwa wanadamu) huamuliwa na sifa za isoforms za mnyororo mzito wa mnyororo (MYH).2 Hapo awali hii ilitokana na kutokuwa na utulivu wa pH ATPase yao,3,4 na baadaye usemi wao wa molekuli wa MYH.5 Hata hivyo, kwa utambuzi na kukubalika baadaye kwa nyuzi "mchanganyiko" zinazoonyesha MYH nyingi kwa uwiano tofauti, nyuzi za misuli ya mifupa zinazidi kuonekana kama mwendelezo badala ya aina tofauti za nyuzi.6 Licha ya haya, uwanja bado unategemea sana MYH kama kiainishaji kikuu cha uainishaji wa myofiber, mtazamo ambao huenda umeathiriwa na mapungufu na upendeleo mkubwa wa tafiti za awali za panya ambazo wasifu wake wa usemi wa MYH na aina mbalimbali za nyuzi hutofautiana na zile za binadamu.2 Hali hiyo inazidi kuwa ngumu zaidi na ukweli kwamba misuli tofauti ya mifupa ya binadamu inaonyesha aina mbalimbali za nyuzi. aina.7 Vastus lateralis ni misuli mchanganyiko yenye wasifu wa kati (na kwa hivyo inawakilisha) wa usemi wa MYH.7 Zaidi ya hayo, urahisi wake wa sampuli unaufanya kuwa misuli iliyosomwa vizuri zaidi kwa wanadamu.
Kwa hivyo, uchunguzi usio na upendeleo wa utofauti wa nyuzi za misuli ya mifupa kwa kutumia zana zenye nguvu za "omics" ni muhimu lakini pia ni changamoto, kwa sehemu kutokana na asili ya nyuzi nyingi za misuli ya mifupa. Hata hivyo, teknolojia za transcriptomics8,9 na proteomics10 zimepitia mapinduzi katika unyeti katika miaka ya hivi karibuni kutokana na maendeleo mbalimbali ya kiteknolojia, kuruhusu uchambuzi wa misuli ya mifupa katika azimio la nyuzi moja. Matokeo yake, maendeleo makubwa yamefanywa katika kuainisha utofauti wa nyuzi moja na mwitikio wao kwa vichocheo vya atrophic na kuzeeka11,12,13,14,15,16,17,18. Muhimu zaidi, maendeleo haya ya kiteknolojia yana matumizi ya kimatibabu, kuruhusu uainishaji wa kina na sahihi zaidi wa dysregulation inayohusiana na ugonjwa. Kwa mfano, pathophysiology ya nemaline miopathy, mojawapo ya magonjwa ya kawaida ya kurithi ya misuli (MIM 605355 na MIM 161800), ni ngumu na ya kutatanisha.19,20 Kwa hivyo, uainishaji bora wa dysregulation ya nyuzi za misuli ya mifupa unaweza kusababisha maendeleo makubwa katika uelewa wetu wa ugonjwa huu.
Tulibuni mbinu za uchambuzi wa transcriptomic na proteomic wa nyuzi za misuli moja ya kiunzi zilizotengwa kwa mikono kutoka kwa sampuli za biopsy za binadamu na kuzitumia kwa maelfu ya nyuzi, na kuturuhusu kuchunguza tofauti za seli za nyuzi za misuli ya kiunzi cha binadamu. Katika kipindi cha kazi hii, tulionyesha nguvu ya uundaji wa transcriptomic na proteomic wa nyuzi za misuli na kutambua protini za metaboli, ribosomal, na seli kama vyanzo muhimu vya utofauti wa nyuzi kati ya nyuzi. Zaidi ya hayo, kwa kutumia mtiririko huu wa kazi wa proteomic, tulibainisha umuhimu wa kimatibabu wa miopathi ya nematodi katika nyuzi za misuli moja ya kiunzi cha mifupa, na kufichua mabadiliko yaliyoratibiwa kuelekea nyuzi zisizo na oksidi bila kujali aina ya nyuzi kulingana na MYH.
Ili kuchunguza tofauti za nyuzi za misuli ya mifupa ya binadamu, tulitengeneza mtiririko wa kazi mbili ili kuwezesha uchanganuzi wa transcriptome na proteome wa nyuzi za misuli moja ya mifupa (Mchoro 1A na Mchoro wa Nyongeza 1A). Tulitengeneza na kuboresha hatua kadhaa za kimbinu, kuanzia uhifadhi wa sampuli na uhifadhi wa uadilifu wa RNA na protini hadi kuboresha upitishaji kwa kila mbinu. Kwa uchanganuzi wa transcriptome, hii ilifikiwa kwa kuingiza misimbopau maalum ya molekuli ya sampuli katika hatua ya awali ya unukuzi wa kinyume, na kuruhusu nyuzi 96 kuunganishwa kwa ajili ya usindikaji bora wa chini. Mfuatano wa kina (± usomaji milioni 1 kwa kila nyuzi) ikilinganishwa na mbinu za jadi za seli moja uliboresha zaidi data ya transcriptome. 21 Kwa proteomics, tulitumia gradient fupi ya chromatografi (dakika 21) pamoja na upatikanaji wa data ya DIA-PASEF kwenye spektromita ya wingi ya timsTOF ili kuboresha kina cha proteome huku tukidumisha upitishaji wa juu. 22,23 Ili kuchunguza tofauti za nyuzi za misuli ya mifupa yenye afya, tuliainisha transcriptome za nyuzi 1,050 kutoka kwa wafadhili 14 wazima wenye afya na proteome za nyuzi 1,038 kutoka kwa wafadhili 5 wazima wenye afya (Jedwali la Nyongeza 1). Katika karatasi hii, seti hizi za data zinajulikana kama transcriptome na proteome za nyuzi 1,000, mtawalia. Mbinu yetu iligundua jumla ya nakala 27,237 na protini 2,983 katika uchambuzi wa transcriptome na proteome wa nyuzi 1,000 (Mchoro 1A, Seti za Data za Nyongeza 1–2). Baada ya kuchuja seti za data za transcriptome na proteome kwa jeni >1,000 zilizogunduliwa na thamani halali za 50% kwa kila nyuzi, uchambuzi uliofuata wa bioinformatics ulifanywa kwa nyuzi 925 na 974 katika transcriptome na proteome, mtawalia. Baada ya kuchuja, wastani wa jeni 4257 ± 1557 na protini za 2015 ± 234 (wastani ± SD) ziligunduliwa kwa kila nyuzi, zikiwa na tofauti ndogo kati ya mtu binafsi (Michoro ya Nyongeza 1B–C, Seti za Data za Nyongeza 3–4). Hata hivyo, tofauti za ndani ya mtu binafsi zilijitokeza zaidi kwa washiriki, pengine kutokana na tofauti katika mavuno ya RNA/protini kati ya nyuzi za urefu tofauti na maeneo ya sehemu mtambuka. Kwa protini nyingi (>2000), mgawo wa tofauti ulikuwa chini ya 20% (Mchoro wa Nyongeza 1D). Mbinu zote mbili ziliruhusu kunasa aina mbalimbali za nakala na protini zenye saini zilizotamkwa sana muhimu kwa misuli kubana (km, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Michoro ya Nyongeza 1E–F). Vipengele vingi vilivyotambuliwa vilikuwa vya kawaida kati ya seti za data za transcriptomic na proteomic (Mchoro wa Nyongeza 1G), na wastani wa nguvu za UMI/LFQ za vipengele hivi zilihusiana vyema (r = 0.52) (Mchoro wa Nyongeza 1H).
Mtiririko wa kazi wa Transcriptomics na proteomics (umeundwa na BioRender.com). Mikunjo ya masafa ya BD yenye nguvu kwa MYH7, MYH2, na MYH1, na vizingiti vilivyohesabiwa kwa mgawo wa aina ya nyuzi. E, F Usambazaji wa usemi wa MYH kwenye nyuzi katika seti za data za transcriptomics na proteomics. G, H Vielelezo vya Ulinganifu na Makadirio ya Utofauti (UMAP) kwa transcriptomics na proteomics zilizopakwa rangi na aina ya nyuzi inayotegemea MYH. I, J Vielelezo vya vipengele vinavyoonyesha usemi wa MYH7, MYH2, na MYH1 katika seti za data za transcriptomics na proteomics.
Hapo awali tulianza kugawa aina ya nyuzinyuzi inayotegemea MYH kwa kila nyuzinyuzi kwa kutumia mbinu iliyoboreshwa ambayo inatumia unyeti wa juu na kiwango cha nguvu cha usemi wa MYH katika seti za data za omics. Uchunguzi wa awali umetumia vizingiti holela kuweka lebo nyuzinyuzi kama aina safi ya 1, aina ya 2A, aina ya 2X, au mchanganyiko kulingana na asilimia maalum ya usemi wa MYHs tofauti11,14,24. Tulitumia mbinu tofauti ambapo usemi wa kila nyuzinyuzi ulipangwa na MYHs tulizotumia kuandika nyuzinyuzi: MYH7, MYH2, na MYH1, sambamba na aina ya 1, aina ya 2A, na nyuzinyuzi za aina ya 2X, mtawalia. Kisha tulihesabu kimahesabu sehemu ya chini ya mkunjo wa kila mkunjo unaotokana na tukautumia kama kizingiti kugawa nyuzi kama chanya (juu ya kizingiti) au hasi (chini ya kizingiti) kwa kila MYH (Mchoro 1B–D). Data hizi zinaonyesha kuwa MYH7 (Mchoro 1B) na MYH2 (Mchoro 1C) zina wasifu tofauti zaidi wa usemi wa kuwasha/kuzima katika kiwango cha RNA ikilinganishwa na kiwango cha protini. Hakika, katika kiwango cha protini, nyuzi chache sana hazikuonyesha MYH7, na hakuna nyuzi iliyokuwa na usemi wa MYH2 100%. Tulitumia vizingiti vya usemi vilivyopangwa awali ili kugawa aina za nyuzi zinazotegemea MYH kwa nyuzi zote katika kila seti ya data. Kwa mfano, nyuzi za MYH7+/MYH2-/MYH1- ziliwekwa kwa aina ya 1, huku nyuzi za MYH7-/MYH2+/MYH1+ zikiwekwa kwa aina mchanganyiko ya 2A/2X (tazama Jedwali la Ziada la 2 kwa maelezo kamili). Kwa kuunganisha nyuzi zote, tuliona usambazaji sawa wa aina za nyuzi zinazotegemea MYH katika viwango vya RNA (Mchoro 1E) na protini (Mchoro 1F), huku muundo wa aina za nyuzi zinazotegemea MYH ukitofautiana kwa watu binafsi, kama ilivyotarajiwa (Mchoro wa Ziada wa 2A). Nyuzi nyingi ziliainishwa kama aina safi ya 1 (34–35%) au aina ya 2A (36–38%), ingawa idadi kubwa ya nyuzi za aina mchanganyiko za 2A/2X pia ziligunduliwa (16–19%). Tofauti ya kushangaza ni kwamba nyuzi safi za aina ya 2X zingeweza kugunduliwa tu katika kiwango cha RNA, lakini si katika kiwango cha protini, ikidokeza kwamba usemi wa haraka wa MYH unadhibitiwa angalau kwa kiasi fulani baada ya kunakili.
Tulithibitisha mbinu yetu ya uchapaji wa nyuzinyuzi ya MYH inayotegemea proteomics kwa kutumia ufifishaji wa nukta unaotegemea kingamwili, na mbinu zote mbili zilifikia makubaliano ya 100% katika kutambua nyuzinyuzi safi za aina ya 1 na aina ya 2A (tazama Mchoro wa Nyongeza 2B). Hata hivyo, mbinu inayotegemea proteomics ilikuwa nyeti zaidi, yenye ufanisi zaidi katika kutambua nyuzinyuzi mchanganyiko, na kupima uwiano wa kila jeni la MYH katika kila nyuzinyuzi. Data hizi zinaonyesha ufanisi wa kutumia mbinu lengwa na nyeti sana inayotegemea omiki ili kuainisha aina za nyuzinyuzi za misuli ya mifupa.
Kisha tulitumia taarifa iliyojumuishwa iliyotolewa na transcriptomics na proteomics ili kuainisha myofibers kwa uwazi kulingana na transcriptom au proteom zao kamili. Kwa kutumia mbinu ya makadirio na makadirio ya uniform manifold (UMAP) ili kupunguza vipimo hadi vipengele sita vikuu (Michoro ya Nyongeza 3A–B), tuliweza kuibua utofauti wa myofibers katika transcriptom (Mchoro 1G) na proteom (Mchoro 1H). Ikumbukwe kwamba, myofibers hazikupangwa kwa makundi na washiriki (Michoro ya Nyongeza 3C–D) au siku za majaribio (Mchoro wa Nyongeza 3E) katika seti za data za transcriptomics au proteomics, zikidokeza kwamba utofauti wa ndani ya mhusika katika nyuzi za misuli ya mifupa ni mkubwa kuliko utofauti wa kati ya mhusika. Katika mchoro wa UMAP, makundi mawili tofauti yanayowakilisha myofibers "za haraka" na "polepole" yalijitokeza (Michoro 1G–H). Miofiber ya MYH7+ (polepole) ilikusanywa kwenye nguzo chanya ya UMAP1, ilhali miofiber ya MYH2+ na MYH1+ (haraka) ilikusanywa kwenye nguzo hasi ya UMAP1 (Michoro 1I–J). Hata hivyo, hakuna tofauti iliyofanywa kati ya aina za nyuzi zinazobadilika haraka (yaani, aina ya 2A, aina ya 2X, au mchanganyiko wa 2A/2X) kulingana na usemi wa MYH, ikidokeza kwamba usemi wa MYH1 (Mchoro 1I–J) au alama zingine za kawaida za myofiber za 2X kama vile ACTN3 au MYLK2 (Michoro ya Nyongeza 4A–B) hautofautishi kati ya aina tofauti za myofiber wakati wa kuzingatia transcriptome au proteome nzima. Zaidi ya hayo, ikilinganishwa na MYH2 na MYH7, nakala chache au protini zilihusiana vyema na MYH1 (Michoro ya Nyongeza 4C–H), ikidokeza kwamba wingi wa MYH1 hauonyeshi kikamilifu transcriptome/proteome ya myofiber. Hitimisho kama hilo lilifikiwa wakati wa kutathmini usemi mchanganyiko wa isoforms tatu za MYH katika kiwango cha UMAP (Michoro ya Nyongeza. 4I–J). Hivyo, ingawa nyuzi 2X zinaweza kutambuliwa katika kiwango cha nakala kulingana na upimaji wa MYH pekee, nyuzi za MYH1+ haziwezi kutofautishwa na nyuzi zingine za haraka wakati wa kuzingatia transcriptome au proteome nzima.
Kama uchunguzi wa awali wa tofauti za nyuzi polepole zaidi ya MYH, tulitathmini protini nne maalum za aina ya nyuzi polepole zilizoanzishwa: TPM3, TNNT1, MYL3, na ATP2A22. Aina ndogo za nyuzi polepole zilionyesha uhusiano wa juu, ingawa sio kamili, wa Pearson na MYH7 katika transcriptomics zote mbili (Mchoro wa Nyongeza 5A) na proteomics (Mchoro wa Nyongeza 5B). Takriban 25% na 33% ya nyuzi polepole hazikuainishwa kama nyuzi safi polepole kwa aina zote za jeni/protini katika transcriptomics (Mchoro wa Nyongeza 5C) na proteomics (Mchoro wa Nyongeza 5D), mtawalia. Kwa hivyo, uainishaji wa nyuzi polepole kulingana na aina nyingi za jeni/protini huanzisha ugumu zaidi, hata kwa protini zinazojulikana kuwa maalum kwa aina ya nyuzi. Hii inaonyesha kwamba uainishaji wa nyuzi kulingana na isoforms za familia moja ya jeni/protini unaweza usionyeshe vya kutosha tofauti halisi ya nyuzi za misuli ya mifupa.
Ili kuchunguza zaidi utofauti wa kifenotipu wa nyuzi za misuli ya mifupa ya binadamu katika kiwango cha modeli nzima ya omics, tulifanya upunguzaji wa vipimo usio na upendeleo wa data kwa kutumia uchanganuzi mkuu wa vipengele (PCA) (Mchoro 2A). Sawa na michoro ya UMAP, wala mshiriki wala siku ya majaribio hawakuathiri mkusanyiko wa nyuzi katika kiwango cha PCA (Michoro ya Nyongeza 6A–C). Katika seti zote mbili za data, aina ya nyuzi inayotegemea MYH ilielezewa na PC2, ambayo ilionyesha kundi la nyuzi za aina ya 1 zinazobadilika polepole na kundi la pili lenye aina ya 2A inayobadilika haraka, aina ya 2X, na nyuzi mchanganyiko za 2A/2X (Mchoro 2A). Katika seti zote mbili za data, makundi haya mawili yaliunganishwa na idadi ndogo ya nyuzi mchanganyiko za aina ya 1/2A. Kama ilivyotarajiwa, uchanganuzi wa uwakilishi kupita kiasi wa viendeshi vikuu vya PC ulithibitisha kwamba PC2 iliendeshwa na sahihi za kubana na kimetaboliki (Mchoro 2B na Michoro ya Nyongeza 6D–E, Seti za Data za Nyongeza 5–6). Kwa ujumla, aina ya nyuzinyuzi inayotegemea MYH ilipatikana kuwa ya kutosha kuelezea tofauti zinazoendelea kando ya PC2, isipokuwa nyuzi zinazoitwa 2X ambazo zilisambazwa katika transcriptome ndani ya kundi la haraka.
A. Vielelezo vya uchambuzi wa vipengele vikuu (PCA) vya seti za data za transcriptome na proteome zilizopakwa rangi kulingana na aina ya nyuzinyuzi kulingana na MYH. B. Uchambuzi wa uboreshaji wa viendeshi vya nakala na protini katika PC2 na PC1. Uchambuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia kifurushi cha clusterProfiler na thamani za p zilizorekebishwa za Benjamini-Hochberg. C, D. Vielelezo vya PCA vilivyopakwa rangi kulingana na masharti ya ontolojia ya jeni la mshikamano kati ya seli (GO) katika masharti ya transcriptome na costamere GO katika proteome. Mishale inawakilisha viendeshi vya nakala na protini na maelekezo yao. E, F. Ukaribu na makadirio ya aina nyingi (UMAP) huangazia vielelezo vya vipengele muhimu vya kliniki vinavyoonyesha gradient za usemi bila kujali aina ya nyuzi polepole/haraka. G, H. Uhusiano kati ya viendeshi vya PC2 na PC1 katika transcriptome na proteome.
Bila kutarajia, aina ya myofiber inayotegemea MYH ilielezea kiwango cha pili cha juu cha utofauti (PC2), ikidokeza kwamba vipengele vingine vya kibiolojia visivyohusiana na aina ya myofiber inayotegemea MYH (PC1) vina jukumu muhimu katika kudhibiti utofauti wa nyuzi za misuli ya mifupa. Uchambuzi wa uwakilishi kupita kiasi wa vichocheo vikuu katika PC1 ulionyesha kuwa utofauti katika PC1 uliamuliwa kimsingi na mshikamano wa seli-seli na kiwango cha ribosomu katika transcriptome, na protini za costameres na ribosomu katika proteome (Mchoro 2B na Takwimu za Nyongeza 6D–E, Seti ya Takwimu za Nyongeza 7). Katika misuli ya mifupa, costameres huunganisha diski ya Z na sarcolemma na huhusika katika upitishaji wa nguvu na ishara. 25 Vielelezo vya PCA vilivyofafanuliwa kwa kutumia mshikamano wa seli-seli (nakala, Mchoro 2C) na vipengele vya costamere (proteome, Mchoro 2D) vilionyesha mabadiliko makubwa ya kushoto katika PC1, ikionyesha kwamba vipengele hivi vimetajiriwa katika nyuzi fulani.
Uchunguzi wa kina zaidi wa mkusanyiko wa myofiber katika kiwango cha UMAP ulionyesha kuwa vipengele vingi vilionyesha mteremko wa usemi wa MYH usiotegemea aina ya myofiber badala ya kundi ndogo la myofiber. Mwendelezo huu ulizingatiwa kwa jeni kadhaa zinazohusiana na hali za kiafya (Mchoro 2E), kama vile CHCHD10 (ugonjwa wa neva), SLIT3 (kudhoofika kwa misuli), CTDNEP1 (ugonjwa wa misuli). Mwendelezo huu pia ulionekana katika proteome, ikiwa ni pamoja na protini zinazohusiana na matatizo ya neva (UGDH), ishara ya insulini (PHIP), na unukuzi (HIST1H2AB) (Mchoro 2F). Kwa pamoja, data hizi zinaonyesha mwendelezo katika tofauti za mtetemo wa polepole/wa haraka usiotegemea aina ya nyuzi katika myofiber tofauti.
Cha kufurahisha ni kwamba, jeni za kiendeshi katika PC2 zilionyesha uwiano mzuri wa transcriptome-proteome (r = 0.663) (Mchoro 2G), ikidokeza kwamba aina za nyuzi zinazopinda polepole na haraka, na haswa sifa za usiri na kimetaboliki za nyuzi za misuli ya mifupa, zinadhibitiwa kwa njia ya unukuzi. Hata hivyo, jeni za kiendeshi katika PC1 hazikuonyesha uwiano wowote wa transcriptome-proteome (r = -0.027) (Mchoro 2H), ikidokeza kwamba tofauti zisizohusiana na aina za nyuzi zinazopinda polepole/haraka zinadhibitiwa kwa kiasi kikubwa baada ya unukuzi. Kwa sababu tofauti katika PC1 zilielezewa kimsingi na istilahi za ontolojia ya jeni za ribosomal, na ikizingatiwa kwamba ribosomu zina jukumu muhimu na maalum katika seli kwa kushiriki kikamilifu katika na kushawishi tafsiri ya protini,31 tulianza kuchunguza tofauti hii isiyotarajiwa ya ribosomal.
Kwanza tulipaka rangi njama ya uchambuzi wa vipengele vikuu vya proteomics kulingana na wingi wa protini katika neno la GOCC "ribosomu ya saitoplazimu" (Mchoro 3A). Ingawa neno hili limetajirishwa upande chanya wa PC1, na kusababisha mteremko mdogo, protini za ribosomu huendesha mgawanyiko katika pande zote mbili za PC1 (Mchoro 3A). Protini za ribosomu zilizotajirishwa upande hasi wa PC1 zilijumuisha RPL18, RPS18, na RPS13 (Mchoro 3B), huku RPL31, RPL35, na RPL38 (Mchoro 3C) zikiwa vichocheo vikuu upande chanya wa PC1. Cha kufurahisha ni kwamba, RPL38 na RPS13 zilionyeshwa sana katika misuli ya mifupa ikilinganishwa na tishu zingine (Mchoro wa Nyongeza 7A). Saini hizi tofauti za ribosomu katika PC1 hazikuonekana katika transcriptome (Mchoro wa Nyongeza 7B), zikionyesha kanuni za baada ya unukuzi.
A. Mchoro wa uchambuzi wa vipengele vikuu (PCA) uliopakwa rangi kulingana na masharti ya ontolojia ya jeni ya ribosomal ya saitoplazimu (GO) kwenye proteome. Mishale inaonyesha mwelekeo wa tofauti inayosababishwa na protini katika njama ya PCA. Urefu wa mstari unalingana na alama ya vipengele vikuu kwa protini fulani. B, C. Mchoro wa vipengele vya PCA kwa RPS13 na RPL38. D. Uchambuzi wa kihierarkia wa protini za ribosomal ya saitoplazimu usiosimamiwa. E. Mfano wa kimuundo wa ribosomal ya 80S (PDB: 4V6X) unaoangazia protini za ribosomal zenye wingi tofauti katika nyuzi za misuli ya mifupa. F. Protini za ribosomal zenye stoichiometry tofauti zilizowekwa karibu na njia ya kutokea ya mRNA.
Dhana za tofauti za ribosomal na utaalamu zimependekezwa hapo awali, ambapo uwepo wa vikundi vidogo tofauti vya ribosomal (tofauti za ribosomal) unaweza kuathiri moja kwa moja utafsiri wa protini katika tishu tofauti32 na seli33 kupitia tafsiri teule ya mabwawa maalum ya nakala ya mRNA34 (utaalamu wa ribosomal). Ili kutambua vikundi vidogo vya protini za ribosomal zinazoonyeshwa kwa pamoja katika nyuzi za misuli ya mifupa, tulifanya uchambuzi wa kihierarkia wa protini za ribosomal katika proteome bila usimamizi (Mchoro 3D, Seti ya Takwimu ya Nyongeza 8). Kama ilivyotarajiwa, protini za ribosomal hazikukusanyika kwa aina ya nyuzi kulingana na MYH. Hata hivyo, tulitambua vikundi vitatu tofauti vya protini za ribosomal; kundi la kwanza (ribosomal_cluster_1) limeunganishwa na RPL38 na hivyo lina ongezeko la usemi katika nyuzi zenye wasifu chanya wa PC1. Kundi la pili (ribosomal_cluster_2) limeunganishwa na RPS13 na limeinuliwa katika nyuzi zenye wasifu hasi wa PC1. Kundi la tatu (ribosomal_cluster_3) halionyeshi usemi tofauti ulioratibiwa katika nyuzi za misuli ya mifupa na linaweza kuchukuliwa kuwa protini ya ribosomal ya misuli ya "kiini". Kundi zote mbili za ribosomal 1 na 2 zina protini za ribosomal ambazo zimeonyeshwa hapo awali kudhibiti tafsiri mbadala (km, RPL10A, RPL38, RPS19, na RPS25) na huathiri ukuaji wa utendaji kazi (km, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Sambamba na matokeo ya PCA, uwakilishi tofauti ulioonekana wa protini hizi za ribosomal kwenye nyuzi pia ulionyesha mwendelezo (Mchoro wa Nyongeza 7C).
Ili kuibua eneo la protini za ribosomu zisizo za kawaida ndani ya ribosomu, tulitumia mfano wa kimuundo wa ribosomu ya binadamu ya 80S (Benki ya Data ya Protini: 4V6X) (Mchoro 3E). Baada ya kutenga protini za ribosomu zinazotokana na makundi tofauti ya ribosomu, maeneo yao hayakuwa yameunganishwa kwa karibu, ikidokeza kwamba mbinu yetu ilishindwa kutoa utajiri kwa maeneo/sehemu fulani za ribosomu. Hata hivyo, cha kufurahisha ni kwamba, uwiano wa protini kubwa ndogo katika kundi la 2 ulikuwa chini kuliko katika makundi ya 1 na 3 (Mchoro wa Nyongeza 7D). Tuliona kwamba protini zenye stoichiometry iliyobadilishwa katika nyuzi za misuli ya mifupa zilikuwa zimewekwa kwa kiasi kikubwa kwenye uso wa ribosomu (Mchoro 3E), sambamba na uwezo wao wa kuingiliana na vipengele vya ndani vya tovuti ya kuingia ya ribosomu (IRES) katika idadi tofauti ya mRNA, na hivyo kuratibu tafsiri teule. 40, 41 Zaidi ya hayo, protini nyingi zenye stoichiometry iliyobadilishwa katika nyuzi za misuli ya mifupa zilikuwa karibu na maeneo ya utendaji kazi kama vile handaki la kutokea la mRNA (Mchoro 3F), ambalo hudhibiti kwa hiari urefu wa tafsiri na kukamatwa kwa peptidi maalum. 42 Kwa muhtasari, data yetu inaonyesha kwamba stoichiometry ya protini za ribosomu za misuli ya mifupa huonyesha utofauti, na kusababisha tofauti kati ya nyuzi za misuli ya mifupa.
Kisha tulianza kutambua sahihi za nyuzinyuzi zinazobadilika haraka na polepole na kuchunguza mifumo ya udhibiti wao wa unukuzi. Kulinganisha makundi ya nyuzinyuzi zinazobadilika haraka na polepole yaliyofafanuliwa na UMAP katika seti mbili za data (Michoro 1G–H na 4A–B), uchambuzi wa transcriptomic na proteomic ulibaini sifa 1366 na 804 zilizojaa tofauti, mtawalia (Michoro 4A–B, Seti za Data za Nyongeza 9–12). Tuliona tofauti zinazotarajiwa katika sahihi zinazohusiana na sarcomeres (km, tropomyosin na troponin), kiunganishi cha msisimko-msukumo (SERCA isoforms), na metaboli ya nishati (km, ALDOA na CKB). Zaidi ya hayo, nakala na protini zinazodhibiti ubiquitination ya protini zilionyeshwa tofauti katika nyuzi zinazobadilika haraka na polepole (km, USP54, SH3RF2, USP28, na USP48) (Michoro 4A–B). Zaidi ya hayo, jeni la protini ya vijidudu RP11-451G4.2 (DWORF), ambalo hapo awali limeonyeshwa kuonyeshwa tofauti katika aina za nyuzi za misuli ya kondoo43 na huongeza shughuli za SERCA katika misuli ya moyo44, liliongezeka kwa kiasi kikubwa katika nyuzi za misuli ya mifupa polepole (Mchoro 4A). Vile vile, katika kiwango cha nyuzi za mtu binafsi, tofauti kubwa zilionekana katika sahihi zinazojulikana kama vile isoforms za lactate dehydrogenase zinazohusiana na kimetaboliki (LDHA na LDHB, Mchoro 4C na Mchoro wa Nyongeza 8A)45,46 pamoja na sahihi maalum za aina ya nyuzi ambazo hazikujulikana hapo awali (kama vile IRX3, USP54, USP28, na DPYSL3) (Mchoro 4C). Kulikuwa na mwingiliano mkubwa wa sifa zilizoonyeshwa tofauti kati ya seti za data za transcriptomic na proteomic (Mchoro wa Nyongeza 8B), pamoja na uhusiano wa mabadiliko ya mkunjo unaoendeshwa hasa na usemi tofauti uliotamkwa zaidi wa sifa za sarcomere (Mchoro wa Nyongeza 8C). Ikumbukwe kwamba baadhi ya sahihi (km USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) zilionyesha udhibiti mkubwa wa baada ya unukuzi katika kiwango cha proteomiki pekee na zilikuwa na wasifu maalum wa usemi wa aina ya nyuzi zinazotetemeka polepole/haraka (Mchoro wa Nyongeza 8C).
Vielelezo vya volkano vya A na B vinavyolinganisha makundi ya polepole na ya haraka yaliyotambuliwa na vielelezo vya makadirio na makadirio ya sare (UMAP) katika Mchoro 1G–H. Vidoti vyenye rangi vinawakilisha nakala au protini ambazo ni tofauti sana katika FDR < 0.05, na vidoti vyeusi vinawakilisha nakala au protini ambazo ni tofauti sana katika mabadiliko ya logi > 1. Uchambuzi wa takwimu wa njia mbili ulifanywa kwa kutumia jaribio la DESeq2 Wald na thamani za p zilizorekebishwa za Benjamini–Hochberg (transcriptomics) au mbinu ya modeli ya mstari wa Limma yenye uchanganuzi wa majaribio wa Bayesian ikifuatiwa na marekebisho ya Benjamini–Hochberg kwa ulinganisho mwingi (proteomics). C Vielelezo vya sahihi vya jeni au protini zilizochaguliwa zilizoonyeshwa tofauti kati ya nyuzi za polepole na za haraka. D Uchanganuzi wa utajiri wa nakala na protini zilizoonyeshwa tofauti sana. Thamani zinazoingiliana zinatajirishwa katika seti zote mbili za data, thamani za transcriptom zinatajirishwa tu katika transcriptom, na thamani za proteom zinatajirishwa tu katika proteom. Uchanganuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia kifurushi cha clusterProfiler chenye thamani za p zilizorekebishwa za Benjamini-Hochberg. E. Vipengele vya unukuzi mahususi vya aina ya nyuzinyuzi vilivyotambuliwa na SCENIC kulingana na alama maalum za kidhibiti zinazotokana na SCENIC na usemi tofauti wa mRNA kati ya aina za nyuzinyuzi. F. Uainishaji wa vipengele vilivyochaguliwa vya unukuzi vilivyoonyeshwa tofauti kati ya nyuzi za polepole na za kasi.
Kisha tulifanya uchanganuzi wa uwakilishi kupita kiasi wa jeni na protini zinazowakilishwa tofauti (Mchoro 4D, Seti ya Data ya Nyongeza 13). Uboreshaji wa njia kwa vipengele vilivyotofautiana kati ya seti mbili za data ulionyesha tofauti zinazotarajiwa, kama vile michakato ya oksidi ya asidi ya mafuta β na metaboli ya ketoni (nyuzi polepole), myofilamenti/misuli kusinyaa (nyuzi za haraka na polepole, mtawalia), na michakato ya kataboliki ya wanga (nyuzi za haraka). Shughuli ya fosfati ya protini ya serine/threonine pia iliongezeka katika nyuzi za haraka, ikiendeshwa na vipengele kama vile vitengo vidogo vya fosfati ya udhibiti na kichocheo (PPP3CB, PPP1R3D, na PPP1R3A), ambavyo vinajulikana kudhibiti metaboli ya glycogen (47) (Michoro ya Nyongeza 8D–E). Njia zingine zilizotajiriwa katika nyuzi za haraka zilijumuisha miili ya usindikaji (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) katika proteome (Mchoro wa Nyongeza 8F), ambayo inaweza kuhusika katika udhibiti wa baada ya unukuzi (48), na shughuli ya vipengele vya unukuzi (SREBF1, RXRG, RORA) katika transcriptome (Mchoro wa Nyongeza 8G). Nyuzi polepole zilitajiriwa katika shughuli ya oksidoreductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Mchoro wa Nyongeza 8H), kumfunga amide (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Mchoro wa Nyongeza 8I), tumbo la nje ya seli (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Mchoro wa Nyongeza 8J), na shughuli ya kipokezi-ligandi (FNDC5, SPX, NENF) (Mchoro wa Nyongeza 8K).
Ili kupata ufahamu zaidi kuhusu udhibiti wa unukuzi unaozingatia sifa za aina ya nyuzi za misuli polepole/haraka, tulifanya uchanganuzi wa uboreshaji wa vipengele vya unukuzi kwa kutumia SCENIC49 (Seti ya Data ya Nyongeza 14). Vipengele vingi vya unukuzi vilitajirishwa kwa kiasi kikubwa kati ya nyuzi za misuli za haraka na polepole (Mchoro 4E). Hii ilijumuisha vipengele vya unukuzi kama vile MAFA, ambayo hapo awali imehusishwa na ukuaji wa haraka wa nyuzi za misuli,50 pamoja na vipengele kadhaa vya unukuzi ambavyo havikuhusishwa hapo awali na programu za jeni maalum za aina ya nyuzi za misuli. Miongoni mwa hivi, PITX1, EGR1, na MYF6 vilikuwa vipengele vya unukuzi vilivyotajirishwa zaidi katika nyuzi za misuli ya haraka (Mchoro 4E). Kwa upande mwingine, ZSCAN30 na EPAS1 (pia inajulikana kama HIF2A) vilikuwa vipengele vya unukuzi vilivyotajirishwa zaidi katika nyuzi za misuli polepole (Mchoro 4E). Sambamba na hili, MAFA ilionyeshwa katika viwango vya juu zaidi katika eneo la UMAP linalolingana na nyuzi za misuli ya haraka, huku EPAS1 ikiwa na muundo tofauti wa usemi (Mchoro 4F).
Mbali na jeni zinazojulikana za usimbaji wa protini, kuna aina nyingi za RNA zisizo na usimbaji ambazo zinaweza kuhusika katika udhibiti wa ukuaji na magonjwa ya binadamu. 51, 52 Katika seti za data za transcriptome, RNA kadhaa zisizo na usimbaji huonyesha umaalumu wa aina ya nyuzinyuzi (Mchoro 5A na Seti ya Data ya Nyongeza 15), ikiwa ni pamoja na LINC01405, ambayo ni mahususi sana kwa nyuzi polepole na inaripotiwa kupungua kwa misuli kutoka kwa wagonjwa walio na mitopathi ya mitochondrial. 53 Kwa upande mwingine, RP11-255P5.3, inayolingana na jeni la lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, inaonyesha umaalumu wa aina ya nyuzinyuzi haraka. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) na RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) zote zinaonyesha umaalumu wa misuli ya mifupa (Vielelezo vya Nyongeza 9A–B) na hazina jeni zinazojulikana za kufyonza ndani ya ujirani wao wa kijenetiki wa 1 Mb, ikidokeza kwamba zina jukumu maalum katika kudhibiti aina za nyuzi badala ya kudhibiti jeni za kufyonza jirani. Wasifu wa usemi maalum wa aina ya nyuzi polepole/haraka wa LINC01405 na RP11-255P5.3, mtawalia, ulithibitishwa kwa kutumia RNAscope (Vielelezo 5B–C).
A. Nakala za RNA zisizo na msimbo hudhibitiwa kwa kiasi kikubwa katika nyuzi za misuli zinazopinda polepole na haraka. B. Picha wakilishi za RNAskopu zinazoonyesha umaalumu wa aina ya nyuzi zinazopinda polepole na haraka za LINC01405 na RP11-255P5.3, mtawalia. Upau wa kipimo = 50 μm. C. Upimaji wa usemi wa RNA usio na msimbo maalum wa aina ya myofiber kama ilivyoamuliwa na RNAskopu (n = biopsies 3 kutoka kwa watu binafsi huru, kulinganisha nyuzi za misuli zinazopinda haraka na polepole ndani ya kila mtu). Uchambuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili. Vielelezo vya kisanduku vinaonyesha robo ya wastani na ya kwanza na ya tatu, huku masharubu yakionyesha thamani za chini na za juu. D. Mtiririko wa kazi mpya wa utambuzi wa protini ya vijidudu (iliyoundwa na BioRender.com). E. Protini ya vijidudu LINC01405_ORF408:17441:17358 imeonyeshwa haswa katika nyuzi za misuli ya mifupa ya polepole (n=biopsies 5 kutoka kwa washiriki huru, kulinganisha nyuzi za misuli ya haraka na polepole katika kila mshiriki). Uchambuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia mbinu ya modeli ya mstari wa Limm pamoja na mbinu ya majaribio ya Bayesian, ikifuatiwa na mbinu ya Benjamini-Hochberg kwa kulinganisha nyingi na marekebisho ya thamani ya p. Vielelezo vya kisanduku vinaonyesha robo ya wastani, ya kwanza na ya tatu, huku masharubu yakielekeza kwenye thamani za juu/za chini kabisa.
Hivi majuzi, tafiti zimeonyesha kwamba nakala nyingi zisizo za usimbaji huandika protini za vijidudu zilizonakiliwa, ambazo baadhi yake hudhibiti utendakazi wa misuli. 44, 55 Ili kutambua protini za vijidudu zenye uwezo wa upekee wa aina ya nyuzi, tulitafuta seti yetu ya data ya proteome ya nyuzi 1000 kwa kutumia faili maalum ya FASTA iliyo na mfuatano wa nakala zisizo za usimbaji (n = 305) zilizopatikana katika seti ya data ya transcriptome ya nyuzi 1000 (Mchoro 5D). Tuligundua protini 197 za vijidudu kutoka kwa nakala 22 tofauti, 71 kati ya hizo zilidhibitiwa tofauti kati ya nyuzi za misuli ya mifupa ya polepole na ya haraka (Mchoro wa Nyongeza 9C na Seti ya Data ya Nyongeza 16). Kwa LINC01405, bidhaa tatu za protini za vijidudu zilitambuliwa, moja ambayo ilionyesha upekee sawa wa nyuzi polepole na nakala yake (Mchoro 5E na Mchoro wa Nyongeza 9D). Kwa hivyo, tulitambua LINC01405 kama jeni linaloandika protini ya vijidudu maalum kwa nyuzi za misuli ya mifupa ya polepole.
Tulitengeneza mtiririko kamili wa kazi kwa ajili ya uainishaji mkubwa wa protini ya nyuzi za misuli ya mtu binafsi na kubaini vidhibiti vya tofauti za nyuzi katika hali zenye afya. Tulitumia mtiririko huu wa kazi ili kuelewa jinsi nemaline myopathies zinavyoathiri tofauti za nyuzi za misuli ya mifupa. Nemaline myopathies ni magonjwa ya misuli yaliyorithiwa ambayo husababisha udhaifu wa misuli na, kwa watoto walioathiriwa, hujitokeza na matatizo mbalimbali ikiwa ni pamoja na shida ya kupumua, scoliosis, na uhamaji mdogo wa viungo. 19,20 Kwa kawaida, katika nemaline myopathies, aina mbalimbali za vimelea katika jeni kama vile actin alpha 1 (ACTA1) husababisha wingi wa muundo wa nyuzi myofiber unaochemka polepole, ingawa athari hii ni tofauti. Tofauti moja muhimu ni troponin T1 nemaline myopathy (TNNT1), ambayo ina wingi wa nyuzi za haraka. Kwa hivyo, uelewa bora wa tofauti zinazosababisha uharibifu wa nyuzi za misuli ya mifupa unaoonekana katika nemaline myopathies unaweza kusaidia kufichua uhusiano tata kati ya magonjwa haya na aina ya nemaline myofiber.
Ikilinganishwa na vidhibiti vyenye afya (n=3 kwa kila kundi), nyuzinyuzi zilizotengwa kutoka kwa wagonjwa wa nemaline myopathy wenye mabadiliko katika jeni za ACTA1 na TNNT1 zilionyesha kudhoofika kwa myofiber au dystrophy iliyoonyeshwa (Mchoro 6A, Jedwali la Nyongeza 3). Hii ilileta changamoto kubwa za kiufundi kwa uchambuzi wa proteomiki kutokana na kiasi kidogo cha nyenzo zinazopatikana. Licha ya haya, tuliweza kugundua protini 2485 katika nyuzinyuzi 272 za mifupa. Baada ya kuchuja angalau protini 1000 zilizopimwa kwa kila nyuzinyuzi, nyuzinyuzi 250 zilifanyiwa uchambuzi wa bioinformatiki uliofuata. Baada ya kuchuja, wastani wa protini 1573 ± 359 kwa kila nyuzinyuzi zilipimwa (Mchoro wa Nyongeza 10A, Seti za Data za Nyongeza 17–18). Ikumbukwe kwamba, licha ya kupungua kwa ukubwa wa nyuzinyuzi, kina cha proteome cha sampuli za wagonjwa wa nemaline myopathy kilipunguzwa kwa kiasi kidogo tu. Zaidi ya hayo, kusindika data hizi kwa kutumia faili zetu za FASTA (ikiwa ni pamoja na nakala zisizo za msimbo) kulituwezesha kutambua protini tano za vijidudu katika myofibers za mifupa kutoka kwa wagonjwa wa nemaline myopathy (Seti ya Data ya Nyongeza 19). Kiwango cha mabadiliko cha proteome kilikuwa pana zaidi, na jumla ya protini katika kundi la udhibiti zilihusiana vyema na matokeo ya uchambuzi wa awali wa proteome ya nyuzinyuzi 1000 (Mchoro wa Nyongeza 10B–C).
A. Picha za hadubini zinazoonyesha kudhoofika kwa nyuzi au dystrophy na wingi wa aina tofauti za nyuzi kulingana na MYH katika ACTA1 na TNNT1 nemaline miopathies (NM). Upau wa kipimo = 100 μm. Ili kuhakikisha urejelezaji wa madoa kwa wagonjwa wa ACTA1 na TNNT1, biopsy tatu za wagonjwa zilitiwa madoa mara mbili hadi tatu (sehemu nne kwa kila kisa) kabla ya kuchagua picha wakilishi. B. Uwiano wa aina ya nyuzi kwa washiriki kulingana na MYH. C. Mchoro mkuu wa uchanganuzi wa vipengele (PCA) wa nyuzi za misuli ya mifupa kwa wagonjwa walio na nemaline miopathies na vidhibiti. D. Nyuzi za misuli ya mifupa kutoka kwa wagonjwa walio na nemaline miopathies na vidhibiti zilikadiriwa kwenye njama ya PCA iliyoamuliwa kutoka kwa nyuzi 1000 zilizochambuliwa katika Mchoro 2. Kwa mfano, michoro ya volkano ikilinganisha tofauti kati ya washiriki walio na nemaline miopathies na vidhibiti vya ACTA1 na TNNT1 nemaline, na kati ya washiriki walio na nemaline miopathies na vidhibiti vya ACTA1 na TNNT1. Miduara yenye rangi huashiria protini ambazo zilikuwa tofauti sana katika π < 0.05, na nukta nyeusi huashiria protini ambazo zilikuwa tofauti sana katika FDR < 0.05. Uchambuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia mbinu ya modeli ya mstari ya Limma na mbinu za majaribio za Bayesian, ikifuatiwa na marekebisho ya thamani ya p kwa ulinganisho mwingi kwa kutumia mbinu ya Benjamini-Hochberg. H. Uchambuzi wa utajiri wa protini zilizoonyeshwa kwa tofauti kubwa katika proteome nzima na katika nyuzi za aina ya 1 na 2A. Uchambuzi wa takwimu ulifanywa kwa kutumia kifurushi cha clusterProfiler na thamani za p zilizorekebishwa za Benjamini-Hochberg. I, J. Vielelezo vya uchambuzi wa vipengele vikuu (PCA) vilivyopakwa rangi na masharti ya matrix ya nje ya seli na ontolojia ya jeni ya mitochondrial (GO).
Kwa sababu nemaline myopathies zinaweza kuathiri uwiano wa aina za nemaline myofiber zinazoonyesha MYH katika misuli ya mifupa, 19,20 kwanza tulichunguza aina za nemaline myofiber zinazoonyesha MYH kwa wagonjwa walio na nemaline myopathies na vidhibiti. Tulibaini aina ya nemaline myofiber kwa kutumia mbinu isiyo na upendeleo iliyoelezwa hapo awali kwa ajili ya jaribio la nemaline myofiber 1000 (Michoro ya Nyongeza. 10D–E) na tena tukashindwa kutambua nemaline myofibers safi za 2X (Mchoro 6B). Tuliona athari tofauti za nemaline myopathies kwenye aina ya nemaline myofiber, kwani wagonjwa wawili walio na mabadiliko ya ACTA1 walikuwa na uwiano ulioongezeka wa nemaline myofibers za aina ya 1, ilhali wagonjwa wawili walio na nemaline myopathies za TNNT1 walikuwa na uwiano uliopungua wa nemaline myofibers za aina ya 1 (Mchoro 6B). Hakika, usemi wa MYH2 na isoforms za troponin za haraka (TNNC2, TNNI2, na TNNT3) ulipungua katika miopathia ya ACTA1-nemaline, ilhali usemi wa MYH7 ulipungua katika miopathia ya TNNT1-nemaline (Mchoro wa Nyongeza 11A). Hii inaendana na ripoti za awali za ubadilishaji wa aina ya myofiber usio wa kawaida katika miopathia ya nemaline.19,20 Tulithibitisha matokeo haya kwa kutumia immunohistochemistry na tukagundua kuwa wagonjwa walio na miopathia ya ACTA1-nemaline walikuwa na wingi wa miyofiberi za aina ya 1, ilhali wagonjwa walio na miopathia ya TNNT1-nemaline walikuwa na muundo tofauti (Mchoro 6A).
Katika kiwango cha proteome ya nyuzi moja, nyuzi za misuli ya mifupa kutoka kwa wagonjwa wa miopathi ya ACTA1 na TNNT1 ya nemaline zilikusanyika pamoja na nyuzi nyingi za udhibiti, huku nyuzi za miopathi ya nemaline ya TNNT1 kwa ujumla zikiwa zimeathiriwa zaidi (Mchoro 6C). Hii ilionekana wazi hasa wakati wa kupanga michoro ya uchambuzi wa vipengele vikuu (PCA) vya nyuzi bandia zilizojaa kwa kila mgonjwa, huku wagonjwa wa miopathi ya nemaline ya TNNT1 2 na 3 wakionekana mbali zaidi na sampuli za udhibiti (Mchoro wa Nyongeza 11B, Seti ya Data ya Nyongeza 20). Ili kuelewa vyema jinsi nyuzi kutoka kwa wagonjwa wa miopathi zinavyolinganishwa na nyuzi zenye afya, tulitumia taarifa za kina zilizopatikana kutoka kwa uchambuzi wa proteome ya nyuzi 1,000 kutoka kwa washiriki wazima wenye afya. Tulipanga nyuzi kutoka kwa seti ya data ya miopathi (wagonjwa na vidhibiti vya miopathi ya nemaline ya ACTA1 na TNNT1) kwenye michoro ya PCA iliyopatikana kutoka kwa uchambuzi wa proteome ya nyuzi 1000 (Mchoro 6D). Usambazaji wa aina za nyuzi za MYH kando ya PC2 katika nyuzi za udhibiti ulikuwa sawa na usambazaji wa nyuzi zilizopatikana kutoka kwa uchambuzi wa proteomiki ya nyuzi 1000. Hata hivyo, nyuzi nyingi katika wagonjwa wa miopathi ya nemaline zilishuka chini ya PC2, zikiingiliana na nyuzi zenye afya zinazobadilika haraka, bila kujali aina yao ya asili ya nyuzi za MYH. Hivyo, ingawa wagonjwa walio na miopathi ya nemaline ya ACTA1 walionyesha mabadiliko kuelekea nyuzi za aina ya 1 walipopimwa kwa kutumia mbinu zinazotegemea MYH, miopathi ya nemaline ya ACTA1 na miopathi ya nemaline ya TNNT1 zilibadilisha proteome ya nyuzi za misuli ya mifupa kuelekea nyuzi zinazobadilika haraka.
Kisha tulilinganisha moja kwa moja kila kundi la wagonjwa na vidhibiti vyenye afya na kutambua protini 256 na 552 zilizoonyeshwa tofauti katika ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies, mtawalia (Mchoro 6E–G na Mchoro wa Nyongeza 11C, Seti ya Data ya Nyongeza 21). Uchambuzi wa utajiri wa jeni ulionyesha kupungua kwa uratibu kwa protini za mitochondrial (Mchoro 6H–I, Seti ya Data ya Nyongeza 22). Cha kushangaza, licha ya utofauti wa aina za nyuzi katika ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies, kupungua huku hakukuwa huru kabisa na aina ya nyuzi inayotegemea MYH (Mchoro 6H na Michoro ya Nyongeza 11D–I, Seti ya Data ya Nyongeza 23). Protini tatu za vijidudu pia zilidhibitiwa katika ACTA1 au TNNT1 nemaline myopathies. Protini ndogo mbili kati ya hizi, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (pia inajulikana kama LINC00598 au Lnc-FOXO1) na ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), zilionyesha wingi tofauti katika nyuzinyuzi za aina ya 1 pekee. ENSG00000215483_TR14_ORF67 imeripotiwa hapo awali kuchukua jukumu katika udhibiti wa mzunguko wa seli. 56 Kwa upande mwingine, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (inayolingana na LINC01798) iliongezeka katika nyuzinyuzi za aina ya 1 na aina ya 2A katika nyuzinyuzi za ACTA1-nemaline ikilinganishwa na vidhibiti vyenye afya (Mchoro wa Nyongeza 12A, Seti ya Data ya Nyongeza 24). Kwa upande mwingine, protini za ribosomal hazikuathiriwa kwa kiasi kikubwa na miopathi ya nemaline, ingawa RPS17 ilipunguzwa katika miopathi ya nemaline ya nemaline ya ACTA1 (Mchoro 6E).
Uchambuzi wa uboreshaji pia ulionyesha kuongezeka kwa michakato ya mfumo wa kinga katika miopathia ya ACTA1 na TNNT1 ya nemaline, huku mshikamano wa seli pia ukiongezeka katika miopathia ya nemaline ya TNNT1 (Mchoro 6H). Uboreshaji wa vipengele hivi vya nje ya seli ulionyeshwa na protini za matrix ya nje ya seli zinazohamisha PCA katika PC1 na PC2 katika mwelekeo hasi (yaani, kuelekea nyuzi zilizoathiriwa zaidi) (Mchoro 6J). Makundi yote mawili ya wagonjwa yalionyesha ongezeko la usemi wa protini za nje ya seli zinazohusika katika majibu ya kinga na mifumo ya ukarabati wa sarcolemmal, kama vile viambatisho (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 na protini yao inayoingiliana S100A1159 (Michoro ya Ziada 12B–C). Mchakato huu umeripotiwa hapo awali kuimarishwa katika dystrophies ya misuli60 lakini, kwa ufahamu wetu, haujahusishwa hapo awali na miopathia ya nemaline. Utendaji wa kawaida wa mashine hii ya molekuli unahitajika kwa ajili ya ukarabati wa sarcolemmal baada ya jeraha na kwa ajili ya kuunganishwa kwa miocytes mpya zilizoundwa na myofibers58,61. Kwa hivyo, ongezeko la shughuli za mchakato huu katika makundi yote mawili ya wagonjwa linaonyesha mwitikio wa kurejesha jeraha linalosababishwa na kutokuwa na utulivu wa myofiber.
Athari za kila miopathi ya nemaline zilihusiana vyema (r = 0.736) na zilionyesha mwingiliano unaofaa (Michoro ya Nyongeza 11A–B), ikionyesha kwamba miopathi ya ACTA1 na TNNT1 ya nemaline zina athari sawa kwenye proteome. Hata hivyo, baadhi ya protini zilidhibitiwa tu katika miopathi ya ACTA1 au TNNT1 ya nemaline (Michoro ya Nyongeza 11A na C). Protini ya profibrotiki MFAP4 ilikuwa mojawapo ya protini zilizoimarishwa zaidi katika miopathi ya TNNT1 ya nemaline lakini haikubadilika katika miopathi ya ACTA1 ya nemaline. SKIC8, sehemu ya PAF1C tata inayohusika na kudhibiti unukuzi wa jeni la HOX, ilipunguzwa katika miopathi ya TNNT1 ya nemaline lakini haikuathiriwa katika miopathi ya ACTA1 ya nemaline (Michoro ya Nyongeza 11A). Ulinganisho wa moja kwa moja wa miopathi ya ACTA1 na TNNT1 ya nemaline ulionyesha kupungua zaidi kwa protini za mitochondrial na ongezeko la protini za mfumo wa kinga katika miopathi ya nemaline ya TNNT1 (Mchoro 6G–H na Michoro ya Ziada 11C na 11H–I). Data hizi zinaendana na atrophy/dystrophy kubwa iliyoonekana katika miopathi ya nemaline ya TNNT1 ikilinganishwa na miopathi ya nemaline ya TNNT1 (Mchoro 6A), ikidokeza kwamba miopathi ya nemaline ya TNNT1 inawakilisha aina kali zaidi ya ugonjwa huo.
Ili kutathmini kama athari zilizoonekana za nemaline miopathy zinaendelea katika kiwango chote cha misuli, tulifanya uchambuzi wa proteomiki wa wingi wa biopsies za misuli kutoka kwa kundi moja la wagonjwa wa nemaline miopathy wa TNNT1 na kuzilinganisha na vidhibiti (n=3 kwa kila kundi) (Mchoro wa Nyongeza 13A, Seti ya Data ya Nyongeza 25). Kama ilivyotarajiwa, vidhibiti vilihusiana kwa karibu katika uchanganuzi mkuu wa vipengele, ilhali wagonjwa wa nemaline miopathy wa TNNT1 walionyesha utofauti mkubwa wa kati ya sampuli sawa na ule unaoonekana katika uchanganuzi mmoja wa nyuzi (Mchoro wa Nyongeza 13B). Uchanganuzi wa wingi ulitoa protini zilizoonyeshwa tofauti (Mchoro wa Nyongeza 13C, Seti ya Data ya Nyongeza 26) na michakato ya kibiolojia (Mchoro wa Nyongeza 13D, Seti ya Data ya Nyongeza 27) iliyoangaziwa kwa kulinganisha nyuzi za mtu binafsi, lakini walipoteza uwezo wa kutofautisha kati ya aina tofauti za nyuzi na walishindwa kuzingatia athari za magonjwa tofauti katika nyuzi.
Kwa pamoja, data hizi zinaonyesha kwamba proteomics za myofiber moja zinaweza kufafanua sifa za kibiolojia za kimatibabu ambazo hazigunduliki kwa njia zinazolengwa kama vile kuzuia kinga mwilini. Zaidi ya hayo, data hizi zinaonyesha mapungufu ya kutumia uchapaji wa nyuzinyuzi za actin (MYH) pekee kuelezea marekebisho ya phenotypic. Hakika, ingawa ubadilishaji wa aina ya nyuzi hutofautiana kati ya myopathies za actin na troponin nemaline, myopathies zote mbili za nemaline hutenganisha uchapaji wa nyuzinyuzi za MYH kutoka kwa metaboli ya nyuzinyuzi za misuli ya mifupa hadi proteome ya misuli ya haraka na isiyo na oksidi nyingi.
Tofauti za seli ni muhimu kwa tishu kukidhi mahitaji yao mbalimbali. Katika misuli ya mifupa, hii mara nyingi huelezewa kama aina za nyuzi zinazojulikana kwa viwango tofauti vya uzalishaji wa nguvu na uchovu. Hata hivyo, ni wazi kwamba hii inaelezea sehemu ndogo tu ya tofauti za nyuzi za misuli ya mifupa, ambayo ni tofauti zaidi, ngumu na yenye pande nyingi kuliko ilivyofikiriwa hapo awali. Maendeleo ya kiteknolojia sasa yametoa mwanga juu ya mambo yanayodhibiti nyuzi za misuli ya mifupa. Hakika, data yetu inaonyesha kwamba nyuzi za aina ya 2X zinaweza zisiwe aina tofauti ya nyuzi za misuli ya mifupa. Zaidi ya hayo, tulitambua protini za kimetaboliki, protini za ribosomal na protini zinazohusiana na seli kama viashiria vikuu vya tofauti za nyuzi za misuli ya mifupa. Kwa kutumia mtiririko wetu wa kazi wa proteomic kwa sampuli za wagonjwa walio na myopathy ya nematode, tulionyesha zaidi kwamba uchapaji wa nyuzi za MYH hauonyeshi kikamilifu tofauti za misuli ya mifupa, haswa wakati mfumo unasumbuliwa. Hakika, bila kujali aina ya nyuzi za MYH, myopathy ya nematode husababisha mabadiliko kuelekea nyuzi za haraka na zisizo na oksidi.
Nyuzi za misuli ya mifupa zimeainishwa tangu karne ya 19. Uchambuzi wa hivi karibuni wa omics umeturuhusu kuanza kuelewa wasifu wa usemi wa aina tofauti za nyuzi za MYH na majibu yao kwa vichocheo tofauti. Kama ilivyoelezwa hapa, mbinu za omics pia zina faida ya unyeti mkubwa wa kupima alama za aina ya nyuzi kuliko mbinu za kitamaduni zinazotegemea kingamwili, bila kutegemea upimaji wa alama moja (au chache) ili kufafanua aina ya nyuzi za misuli ya mifupa. Tulitumia mtiririko wa kazi unaosaidiana wa transcriptomic na proteomic na kuunganisha matokeo ili kuchunguza udhibiti wa unukuzi na baada ya unukuzi wa tofauti za nyuzi katika nyuzi za misuli ya mifupa ya binadamu. Mtiririko huu wa kazi ulisababisha kushindwa kutambua nyuzi safi za aina ya 2X katika kiwango cha protini katika vastus lateralis ya kundi letu la vijana wenye afya njema. Hii inaendana na tafiti za awali za nyuzi moja ambazo zilipata <1% nyuzi safi za 2X katika vastus lateralis yenye afya, ingawa hii inapaswa kuthibitishwa katika misuli mingine katika siku zijazo. Tofauti kati ya kugundua nyuzi karibu safi za 2X katika kiwango cha mRNA na nyuzi mchanganyiko za 2A/2X pekee katika kiwango cha protini inashangaza. Usemi wa mRNA ya isoform ya MYH si wa circadian,67 ikidokeza kwamba hatuna uwezekano wa "kukosa" ishara ya mwanzo ya MYH2 katika nyuzi zinazoonekana safi za 2X katika kiwango cha RNA. Maelezo moja yanayowezekana, ingawa ni ya kufikirika tu, yanaweza kuwa tofauti katika uthabiti wa protini na/au mRNA kati ya isoform za MYH. Hakika, hakuna nyuzi haraka iliyo safi 100% kwa isoform yoyote ya MYH, na haijulikani wazi kama viwango vya usemi wa mRNA ya MYH1 katika safu ya 70-90% vitasababisha wingi sawa wa MYH1 na MYH2 katika kiwango cha protini. Hata hivyo, wakati wa kuzingatia transcriptome nzima au proteome, uchambuzi wa nguzo unaweza kutambua kwa ujasiri makundi mawili tofauti yanayowakilisha nyuzi za misuli ya mifupa ya polepole na ya haraka, bila kujali muundo wao sahihi wa MYH. Hii inaendana na uchambuzi unaotumia mbinu za transcriptomic za nucleus moja, ambazo kwa kawaida hutambua makundi mawili tofauti ya myonuclear pekee. 68, 69, 70 Zaidi ya hayo, ingawa tafiti za awali za proteomiki zimegundua nyuzi za aina ya 2X, nyuzi hizi hazijikusanyiki kando na nyuzi zingine za haraka na zinaonyesha idadi ndogo tu ya protini nyingi tofauti ikilinganishwa na aina zingine za nyuzi kulingana na MYH. 14 Matokeo haya yanaonyesha kwamba tunapaswa kurudi kwenye mtazamo wa mapema wa karne ya 20 wa uainishaji wa nyuzi za misuli, ambao uligawanya nyuzi za misuli ya mifupa ya binadamu sio katika madarasa matatu tofauti kulingana na MYH, lakini katika makundi mawili kulingana na sifa zao za kimetaboliki na za kufyonza. 63
Muhimu zaidi, utofauti wa myofiber unapaswa kuzingatiwa kwa vipimo vingi. Uchunguzi wa awali wa "omics" umeelekeza katika mwelekeo huu, ukidokeza kwamba nyuzi za misuli ya mifupa hazifanyi makundi tofauti bali hupangwa kwa njia ya mwendelezo. 11, 13, 14, 64, 71 Hapa, tunaonyesha kwamba, pamoja na tofauti katika sifa za usiri na kimetaboliki za misuli ya mifupa, nyuzi za myofiber zinaweza kutofautishwa kwa vipengele vinavyohusiana na mwingiliano wa seli-seli na utaratibu wa utafsiri. Hakika, tulipata utofauti wa ribosomu katika nyuzi za misuli ya mifupa ambao huchangia utofauti bila kujali aina za nyuzi polepole na za haraka. Sababu ya msingi ya utofauti huu mkubwa wa myofiber, bila kujali aina ya nyuzi polepole na za haraka, bado haijulikani wazi, lakini inaweza kuashiria mpangilio maalum wa anga ndani ya misuli ya fascicles ambayo hujibu vyema nguvu na mizigo maalum,72 mawasiliano maalum ya seli au viungo maalum na aina zingine za seli katika mazingira madogo ya misuli73,74,75 au tofauti katika shughuli za ribosomu ndani ya nyuzi za myofiber za kibinafsi. Hakika, heteroplasmia ya ribosomal, ama kupitia ubadilishaji wa paralogous wa RPL3 na RPL3L au katika kiwango cha 2′O-methylation ya rRNA, imeonyeshwa kuhusishwa na hypertrophy ya misuli ya mifupa76,77. Matumizi ya multi-omic na anga pamoja na uainishaji wa utendaji kazi wa myofibers za kibinafsi yataendeleza zaidi uelewa wetu wa biolojia ya misuli katika kiwango cha multi-omic78.
Kwa kuchambua proteome za myofiberi moja kutoka kwa wagonjwa walio na nemaline myopathies, pia tulionyesha manufaa, ufanisi, na matumizi ya proteomeki moja ya myofiberi ili kufafanua pathophysiolojia ya kimatibabu ya misuli ya mifupa. Zaidi ya hayo, kwa kulinganisha mtiririko wetu wa kazi na uchambuzi wa proteomeki wa kimataifa, tuliweza kuonyesha kwamba proteomeki moja ya myofiberi hutoa kina sawa cha taarifa kama proteomeki za tishu za kimataifa na kupanua kina hiki kwa kuhesabu tofauti kati ya nyuzi na aina ya myofiberi. Mbali na tofauti zinazotarajiwa (ingawa ni tofauti) katika uwiano wa aina ya nyuzi zilizoonekana katika ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies ikilinganishwa na vidhibiti vyenye afya,19 pia tuliona urekebishaji wa oksidi na nje ya seli bila kujali ubadilishaji wa aina ya nyuzi unaosababishwa na MYH. Fibrosis imeripotiwa hapo awali katika nemaline myopathies za TNNT1.19 Hata hivyo, uchambuzi wetu unajengwa juu ya ugunduzi huu kwa kufichua pia viwango vilivyoongezeka vya protini zinazohusiana na msongo wa nje ya seli, kama vile viambatisho, vinavyohusika katika utaratibu wa ukarabati wa sarcolemmal, katika nemaline myofibers kutoka kwa wagonjwa walio na nemaline myopathies za ACTA1 na TNNT1.57,58,59 Kwa kumalizia, viwango vilivyoongezeka vya viambatisho katika nemaline myofibers kutoka kwa wagonjwa walio na nemaline myopathies vinaweza kuwakilisha mwitikio wa seli kwa kutengeneza nemaline myofibers zilizopungua sana.
Ingawa utafiti huu unawakilisha uchanganuzi mkubwa zaidi wa misuli-misuli-omiki wa nyuzi moja hadi sasa, si bila mapungufu. Tulitenga nyuzi za misuli ya mifupa kutoka kwa sampuli ndogo na yenye kufanana ya washiriki na misuli moja (vastus lateralis). Kwa hivyo, haiwezekani kuondoa uwepo wa idadi maalum ya nyuzi katika aina za misuli na katika hali mbaya ya fiziolojia ya misuli. Kwa mfano, hatuwezi kuondoa uwezekano wa kundi la nyuzi zenye kasi ya juu (k.m., nyuzi safi za 2X) zinazojitokeza katika wanariadha waliofunzwa sana na/au wanariadha wa nguvu79 au wakati wa vipindi vya kutokuwa na shughuli za misuli66,80. Zaidi ya hayo, ukubwa mdogo wa sampuli wa washiriki ulituzuia kuchunguza tofauti za kijinsia katika utofauti wa nyuzi, kwani uwiano wa aina ya nyuzi unajulikana kutofautiana kati ya wanaume na wanawake. Zaidi ya hayo, hatukuweza kufanya uchanganuzi wa transcriptomic na proteomic kwenye nyuzi za misuli au sampuli sawa kutoka kwa washiriki sawa. Tunapoendelea kuboresha uchanganuzi wa seli moja na myofiber moja kwa kutumia uchanganuzi wa omics ili kufikia uingizaji wa sampuli wa kiwango cha chini sana (kama inavyoonyeshwa hapa katika uchanganuzi wa nyuzi kutoka kwa wagonjwa walio na mitochondrial mitochondrial misopathy), fursa ya kuchanganya mbinu za omics nyingi (na zinazofanya kazi) ndani ya nyuzi za misuli moja inakuwa dhahiri.
Kwa ujumla, data yetu hutambua na kuelezea vichocheo vya unukuzi na baada ya unukuzi wa tofauti za misuli ya mifupa. Hasa, tunawasilisha data inayopinga fundisho la muda mrefu katika fiziolojia ya misuli ya mifupa linalohusiana na ufafanuzi wa kawaida wa aina za nyuzinyuzi unaotegemea MYH. Tunatumai kusasisha mjadala na hatimaye kufikiria upya uelewa wetu wa uainishaji na tofauti za nyuzinyuzi za misuli ya mifupa.
Washiriki kumi na wanne wa Kizungu (wanaume 12 na wanawake 2) walikubali kwa hiari kushiriki katika utafiti huu. Utafiti huo uliidhinishwa na Kamati ya Maadili ya Hospitali ya Chuo Kikuu cha Ghent (BC-10237), ulifuata Azimio la Helsinki la 2013, na ulisajiliwa katika ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Sifa za jumla za washiriki zimewasilishwa katika Jedwali la Ziada 1. Baada ya kupata idhini ya maneno na maandishi, washiriki walifanyiwa uchunguzi wa kimatibabu kabla ya kuingizwa katika utafiti. Washiriki walikuwa vijana (miaka 22-42), wenye afya njema (hakuna hali za kiafya, hakuna historia ya kuvuta sigara), na wenye shughuli za kimwili kwa kiasi. Kiwango cha juu cha ulaji wa oksijeni kiliamuliwa kwa kutumia kipimo cha hatua kwa ajili ya kutathmini utimamu wa mwili kama ilivyoelezwa hapo awali. 81
Sampuli za biopsy ya misuli zilikusanywa wakati wa mapumziko na katika hali ya kufunga mara tatu, siku 14 tofauti. Kwa sababu sampuli hizi zilikusanywa kama sehemu ya utafiti mkubwa, washiriki walitumia placebo (lactose), pinzani ya H1-receptor (540 mg ya fexofenadine), au pinzani ya H2-receptor (40 mg ya famotidine) dakika 40 kabla ya biopsy. Tumeonyesha hapo awali kwamba wapinzani hawa wa histamini wa vipokezi hawaathiri utimamu wa misuli ya mifupa iliyopumzika81, na hakuna mkusanyiko wowote unaohusiana na hali ulioonekana katika michoro yetu ya udhibiti wa ubora (Michoro ya Nyongeza 3 na 6). Lishe sanifu (41.4 kcal/kg uzito wa mwili, 5.1 g/kg wanga wa uzito wa mwili, 1.4 g/kg protini ya uzito wa mwili, na 1.6 g/kg mafuta ya uzito wa mwili) ilidumishwa kwa saa 48 kabla ya kila siku ya majaribio, na kifungua kinywa sanifu (1.5 g/kg wanga wa uzito wa mwili) kililiwa asubuhi ya siku ya majaribio. Chini ya ganzi ya ndani (0.5 ml 1% lidocaine bila epinephrine), biopsies za misuli zilipatikana kutoka kwa misuli ya vastus lateralis kwa kutumia njia ya kunyonya ya Bergström.82 Sampuli za misuli zilipachikwa mara moja kwenye RNAlater na kuhifadhiwa kwa 4°C hadi kukatwa kwa nyuzinyuzi kwa mikono (hadi siku 3).
Vifurushi vya myofiber vilivyotengwa hivi karibuni vilihamishiwa kwenye chombo kipya cha RNAlater kwenye bakuli la kukuzia. Kisha nyuzinyuzi za myofiber za kibinafsi zilikatwa kwa mikono kwa kutumia darubini ya stereo na kibano kidogo. Nyuzi ishirini na tano zilikatwa kutoka kwa kila biopsy, zikizingatia sana kuchagua nyuzi kutoka maeneo tofauti ya biopsy. Baada ya kukatwa, kila nyuzinyuzi ilizamishwa kwa upole katika 3 μl ya bafa ya lysis (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) iliyo na proteinase K na vimeng'enya vya DNase ili kuondoa protini na DNA zisizohitajika. Lisisi ya seli na kuondolewa kwa protini/DNA kisha kulianzishwa kwa mvuke mfupi, kuzungusha kioevu kwenye microcentrifuge, na kuingizwa kwenye joto la kawaida (dakika 10). Kisha lysate iliingizwa kwenye kipima joto (T100, Bio-Rad) kwa 37°C kwa dakika 5, 75°C kwa dakika 5, na kisha kuhifadhiwa mara moja kwa -80°C hadi usindikaji zaidi.
Maktaba za RNA zenye poliadenili zinazopatana na Illumina zilitayarishwa kutoka kwa 2 µl ya lysate ya myofiber kwa kutumia Kitengo cha Maandalizi ya Maktaba ya QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen). Mbinu za kina zinaweza kupatikana katika mwongozo wa mtengenezaji. Mchakato huanza na usanisi wa cDNA ya nyuzi ya kwanza kwa unukuzi wa kinyume, ambapo vitambulisho vya kipekee vya molekuli (UMI) na misimbopau maalum ya i1 huletwa ili kuhakikisha ujumuishaji wa sampuli na kupunguza utofauti wa kiufundi wakati wa usindikaji wa chini. Kisha cDNA kutoka kwa nyuzi 96 za myofiber huunganishwa na kusafishwa kwa shanga za sumaku, baada ya hapo RNA huondolewa na usanisi wa nyuzi ya pili hufanywa kwa kutumia vitangulizi vya nasibu. Maktaba husafishwa kwa shanga za sumaku, lebo maalum za i5/i7 huongezwa, na PCR huongezwa. Hatua ya mwisho ya utakaso hutoa maktaba zinazopatana na Illumina. Ubora wa kila bwawa la maktaba ulipimwa kwa kutumia Kitengo cha Uchambuzi wa DNA cha Vipande Vidogo vya Unyeti wa Juu (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Kulingana na upimaji wa Qubit, mabwawa yalikusanywa zaidi katika viwango vya equimolar (2 nM). Kisha mabwawa yaliyotokana yalipangwa kwa mpangilio kwenye kifaa cha NovaSeq 6000 katika hali ya kawaida kwa kutumia Kifaa cha Vitendanishi cha NovaSeq S2 (nyukleotidi 1 × 100) zenye upakiaji wa nM 2 (4% PhiX).
Bomba letu linatokana na bomba la uchambuzi wa data la QuantSeq Pool la Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data iliondolewa kwenye multiplex kwanza kwa kutumia bcl2fastq2 (v2.20.0) kulingana na faharasa ya i7/i5. Soma 2 kisha iliondolewa kwenye multiplex kwa kutumia idemux (v0.1.6) kulingana na msimbopau wa sampuli ya i1 na mfuatano wa UMI ulitolewa kwa kutumia umi_tools (v1.0.1). Kisha usomaji ulipunguzwa kwa kutumia cutadapt (v3.4) katika raundi nyingi ili kuondoa usomaji mfupi (
Muda wa chapisho: Septemba 10-2025